触发肿瘤微环境的药物递送：MnO2诱导构筑聚合物囊泡

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分子自组装是自然界最本质的内容之一。然而，聚合物的水相自组装仍是自组装领域内亟待应对的主要挑战。基于此，我们提出了一种在水相中通过MnO₂成核诱导水溶性嵌段共聚物自组装制备可控形态和高稳定性聚合物囊泡的方法。在该聚合物囊泡中，MnO₂不仅可以作为交联剂稳定聚合物囊泡结构，而且在谷胱甘肽作用下能够发生分解，进而促使聚合物囊泡解离。鉴于以上特性，我们将其应用于肿瘤微环境触发的抗肿瘤药物递送，发现该药物递送系统不仅具有优异的肿瘤抑制作用，还能克服抗肿瘤药物阿霉素的心脏毒性。

Aqueous Self-Assembly of Block Copolymers to Form Manganese Oxide-based Polymeric Vesicles for Tumor Microenvironment-activated Drug Delivery

Yalei Miao, Yudian Qiu, Mengna Zhang, Ke Yan, Panke Zhang, Siyu Lu, Zhongyi Liu*, Xiaojing Shi*, Xubo Zhao*

Nano‑Micro Lett.(2020)12:124

https://doi.org/10.1007/s40820-020-00447-9

本文亮点

1. 利用二氧化锰成核诱导嵌段共聚物水相自组装形成聚合物囊泡。2. 聚合物囊泡具有优异的结构稳定性，磷酸盐缓冲溶液中100天不聚沉。3. 聚合物囊泡药物递送系统具有良好的肿瘤微环境响应性，展现出较高的肿瘤抑制能力，且能克服阿霉素的心脏毒性。

内容简介

郑州大学化学学院赵旭波、刘仲毅老师团队和郑州大学动物实验中心石晓静老师合作提出了一种简单有效的水相自组装构筑聚合物囊泡的方法，并将其应用于抗肿瘤药物递送。具体步骤如下：通过原子转移自由基聚合、点击化学、水解反应制备得到两亲性嵌段共聚物，并在水相中温和条件下，配位介导吸附Mn²⁺，利用MnO₂原位成核诱导嵌段共聚物(PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈)自组装，形成聚合物组装体(PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂)。该组装体形态为粒径约30 nm的囊泡，其在生理介质中具有优良的稳定性，且DOX的封装效率和载药量均高达94%。在肿瘤组织中高水平GSH和弱酸性响应下，MnO₂转化为Mn²⁺，促进了PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的分解，实现抗肿瘤药物的递送。特别地，体内研究证明DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂可以克服DOX的心脏毒性。

MnO₂成核诱导嵌段共聚物自组装过程分三个步骤进行：(i)在初始阶段将共聚物链完全溶解在水相中；(ii)MnO₂成核过程降低了PAA嵌段的可溶性以驱使其进行相分离；(iii)在最后阶段PAA/MnO₂链成核诱导共聚物自组装。此过程中，MnO₂成核不仅诱导了嵌段共聚物进行原位自组装，而且还扮演了调节嵌段共聚物自组装过程的交联剂，以优化其形态且增强其结构稳定性。该方法不仅为聚合物自组装结构的拓展提供了一种新的思路，也展示了刺激响应性聚合物组装体在药物递送领域内的潜在应用。

图文导读

I PAA₆₈-b-PAA₈₆-b-PAA₆₈的制备如图1a所示，除内部亚甲基和甲基的特征质子峰外，在1.44 ppm处的特征峰表明PtBA–b–PEG₈₆–b–PtBA中叔丁基(-C(CH₃)₃)的存在。通过定量计算a与c的峰面积比得到tBA的聚合度，并成功获得了结构明确的PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈嵌段共聚物。依据图1b所示的凝胶渗透色谱结果，PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈的M_n为24916 Da，这与PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈的¹H NMR光谱结果吻合。此外，PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈的PDI(M_w/M_n)为1.24，表明其存在窄的M_w分布。另外，图1c显示在1735 cm^-1和1394 cm^-1处的特征吸收峰分别归属于Br–PEG₈₆–Br的酯羰基与PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈的叔丁基。这与¹H NMR光谱分析的结果一致。在PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈的¹H NMR光谱中，叔丁基的特征质子峰消失，表明PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈中叔丁基的成功水解。此外，在PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈的FT-IR光谱中，1735 cm^-1处叔丁基羧基的伸缩振动吸收峰消失，表明它是由PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈生成的。因此，所制备的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈共聚物具有丰富的羧基，可用于螯合Mn²⁺。

图1. (a)¹H NMR谱图：HO–PEG₈₆–OH(Ⅰ)、Br–PEG₈₆–Br(Ⅱ)、PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈(Ⅲ)和PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈(Ⅳ)；(b)GPC色谱图：HO–PEG₈₆–OH和PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈；(c)FT-IR光谱图：HO–PEG₈₆–OH、Br–PEG₈₆–Br、PtBA₆₈–b–PEG₈₆–b–PtBA₆₈和PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈。

II PAA₆₈-b-PAA₈₆-b-PAA₆₈/MnO₂的制备如图2a所示，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂为直径约30 nm的囊泡，这与使用高角度暗场扫描透射电子显微镜(HADDF-STEM，图2b)和原子力显微镜(AFM，图2d和e)的结果一致。此外，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的HADDF-STEM图像也显示了其囊泡形态。如图2f所示，O和Mn元素在聚合物囊泡中均匀分布，表明Mn²⁺转化为了MnO₂。此外，该结果与图2g中的EDS分析和图2h中的XPS结果一致，这进一步证实了MnO₂的存在。为了确认锰元素的化学价，图2k中给出了Mn2p的精细谱。如图2i、j和k所示，样品的C1s光谱分为三个峰，284.8、286.7和288.2 eV分别归属于C-H/C-C、C-O-C和C=O，这表明了共聚物的存在；在O1s的精细谱中，位于530.6 eV处的特征峰，表明这个杂化物结构中有MnO₂的存在；在Mn2p光谱中，在结合能653.1和641.1 eV处的两个特定峰，表明MnO₂中存在Mn⁴⁺。另外，在图2c中，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂囊泡的HR-TEM图像中晶面间距为1.57和3.14Å，MnO₂的特征晶格条纹的出现进一步证明了MnO₂的存在。此外，通过ICP-MS测定PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂囊泡中MnO₂的含量约为4 wt%。

图2. PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的(a)TEM、(b和f)HADDF-STEM、(c)HR-TEM、(d和e)AFM图像、(g)EDS、(h)XPS光谱和(i)C1s、(j)O1s、(k)Mn2p的精细谱。

III 药物递送系统的结构稳定性和可降解性如图3a中DLS所示，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂结构的流体动力学直径要比TEM下观察到的尺寸要大，这归因于在水相中PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂结构中亲水性PEG片段的极度伸展，而这些片段在TEM视野下是塌陷的。如图3b显示，在110h内，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂表现出一系列稳定的流体动力学直径。另外，依据不同时间点的丁达尔效应，证明PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂结构具有出色的稳定性。与图3c所示的新鲜PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂相比，图3d所示的经酸和还原性双敏感触发剂(pH 5.0和10 mM GSH)处理后的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂，观察到PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的分解。
与图3e中PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂囊泡的D_h相比，图3a中DOX负载后的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂囊泡的D_h增加，这表明DOX分子的成功负载。图3f中评估了DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的结构稳定性，这表明其在PBS中，110 h时间内表现出了良好的稳定性。此外，如图3f所示，观察到分散体系在不同时间点的丁达尔效应，证明了DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂具有优异的稳定性。如图3h和j所示，经酸和还原性双敏感触发剂(pH 5.0含10 mM GSH)处理后，观察到DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的形貌变化，表明DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的分解。这些包括PEG和PAA在内的可降解产物已获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准。此外，释放出来的包括Mn²⁺在内的其他产物均易于被肾脏代谢。如图3i所示，MnO₂向Mn²⁺的转化可能有助于PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的分解。这将促进聚合物-无机杂化物作为药物递送系统的广泛应用，尤其是在以抗癌药物为重点的癌症治疗方面。图3. (a)PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的D_h分布；(b)在PBS中不同时间的流体动力学粒径和丁达尔效应；PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂降解前(c)和后(d)的TEM图像；DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的(e)D_h分布以及(f)在不同时间的PBS中的流体动力学粒径和丁达尔效应；DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂解离前(g)和后(h)的TEM图像；在pH 5.0含10 mM GSH的PBS中，(i)PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂和(j)DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂降解的示意图。IV 载药PAA₆₈-b-PAA₈₆-b-PAA₆₈/MnO₂的体外释放

如图4a所示，DOX释放曲线表明在正常生理条件下，仅有6%的药物累积释放，而随着pH从6.5降至5.0，在60 h内药物的累积释放量分别为22%和50%。与此同时，与图4a中pH 7.4条件下相比，引入10μM GSH只会稍微增加DOX的释放。

pH 5.0含10 mM GSH(生物学相关水平为2-10 mM)的条件明显促进了DOX的释放，并且在24 h内观察到了DOX的释放行为。特别地，如图4a所示，在pH 5.0含10 mMGSH下，DOX的最终累积释放量高达75%。如图4b所示，在不同的时间间隔评估了DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中DOX在细胞内的释放。如图4c所示，与游离DOX相比，在每个培育时间内，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂在细胞内释放缓慢，这表明DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂先进行降解随后进行释放药物。当培育时间增加到12 h时，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂几乎释放了所有药物，这与DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中DOX的累积释放行为基本一致。如图4a所示，在pH 5.0含10 mM GSH存在下，采用CLSM技术检测MCF-7细胞中从DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中释放的DOX分子在细胞内的分布。共培育9 h后，与图4e中游离的DOX相比，图4d中DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂在细胞核处观察到了更明显的DOX分子的红色荧光，这表明DOX负载的AA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂可更有效地将DOX分子递送至细胞核内。这些结果表明，聚合物囊泡在肿瘤的酸和还原性双重触发下，实现了DOX的按需释放。图4. (a)在模拟体液中，DOX从DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中的累积释放量；(b)在不同时间范围内，MCF-7细胞中从DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中释放至细胞内的DOX；(c)游离DOX作为对照组；(d)培育9 h后，从DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂中释放至细胞内的DOX进行CLSM测试；(e)游离DOX作对照组，比例尺：50 μm。对于CLSM和流式细胞数分析，等效DOX剂量为2.5 μg mL^-1。

V 载药PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂的体内治疗作用

在带有MCF-7肿瘤的小鼠中，评估了DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂在体内的抗肿瘤疗效。如图5a所示，31天后，盐水组的肿瘤明显增大。此外，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组的肿瘤大小也显示出相似的趋势。而与盐水组和PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组相比，用DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂治疗31天后的肿瘤明显变小。这种减小趋势与游离DOX组的结果一致，表明DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂表现出优异的抗肿瘤疗效。如图5b所示，实验结束时将这些小鼠的肿瘤组织切除并称重，结果表明，与游离DOX组相比，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组表现出了相似的肿瘤抑制作用。如图5c所示，在治疗期间，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组的小鼠体重与PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组的小鼠体重相似。特别地，在31天后，游离DOX组的小鼠体重明显降低了约24%，说明了DOX的严重毒副作用。如图5d所示，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂和游离DOX组的肿瘤大小分别从约100 mm³略微增加到约220和290 mm³。相反，PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈组的肿瘤大小明显从约100 mm³增加到约910 mm³。如图5e所示，根据主要器官的组织学分析，在这些组织中，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂并未引起明显的病理变化，而游离DOX组则引起了明显的病理变化。特别地，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂组的肝脏和心脏证明了DOX的心脏毒性。上述观察到的所有结果均表明，DOX负载的PAA₆₈–b–PEG₈₆–b–PAA₆₈/MnO₂表现出了更高的肿瘤抑制性，而未发现已知的DOX心脏毒性，这很可能是与MnO₂-聚合物杂化物独特的囊泡结构有关。
图5. MCF-7肿瘤小鼠在体内癌症化疗31天后切除的(a)肿瘤图像(比例尺：1 cm)和(b)肿瘤重量；在治疗期间MCF-7肿瘤小鼠的(c)体重变化和(d)肿瘤大小变化；(e)在体内进行癌症化疗31天后，MCF-7肿瘤小鼠主要组织的切片分析，比例尺：200 μm。

作者简介

赵旭波
本文通讯作者
郑州大学 硕士生导师▍主要研究领域主要致力于刺激响应性聚合物结构设计及聚合物组装结构过程控制的研究，同时探索其在生物医学领域内的应用。

▍主要研究成果

在Biomacromolecules、Polym. Chem.、ACS Appl. Mater. Interface、J. Mater. Chem. B、Bioconjugate Chem.、Langmuir及Mol. Pharmaceutics等学术期刊以第一作者或通讯作者发表论文20余篇，申请中国发明专利3项。主持国家自然科学基金青年基金、中国博士后科学基金及中央高校基本科研业务费等项目。▍Email: [e-mail]

撰稿：原文作者

编辑：《纳微快报》编辑部

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Nano-Micro Letters《纳微快报》是上海交通大学主办、Springer Nature合作开放获取(open-access)出版的英文学术期刊，主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, commentary, perspective, letter, highlight, news, etc)，包括微纳米材料的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、吸波、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、SCOPUS、DOAJ、CNKI、CSCD、知网、万方、维普等数据库收录。2019 JCR影响因子：12.264。在物理、材料、纳米三个领域均居Q1区(前15%)。2019 CiteScore：12.9，材料学科领域排名第4 (4/120)。中科院期刊分区：材料科学1区TOP期刊。全文免费下载阅读(http://springer.com/40820)，欢迎关注和投稿。
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